Вікіпедія

Сайленсинг генів

біологічний процес

Сайленсинг генів (від. англ. gene silencing — пригнічення експресії генів, «приглушення», або «вимкнення» генів) — це регулювання експресії генів у клітині для запобігання експресії певного гена[1][2]. Сайленсинг генів може відбуватися під час транскрипції або трансляції і часто використовується в дослідженнях. Зокрема, все частіше застосовуються методи, що дозволяють вимикати гени для виробництва терапевтичних засобів для боротьби з раком та іншими захворюваннями, такими як інфекційні захворювання та нейродегенеративні розлади.

Термін «сайленсинг генів» часто використовують як синонім нокдауну генів[3][4]. Коли ген піддають сайленсингу, його експресія знижується . На противагу цьому, коли ген піддають нокауту, він повністю стирається з геному організму і, таким чином, не має експресії . Сайленсинг генів вважається механізмом нокдауну генів, оскільки методи, що застосовуються для сайленсингу, такі як RNAi, CRISPR або siRNA, як правило, знижують експресію гена щонайменше на 70 %, але повністю її не усувають. Методи, що використовують сайленсинг, часто є більш універсальними, ніж нокаут генів, оскільки вони дозволяють дослідникам вивчати гени, критично необхідні для виживання тваринних моделей, і які неможливо повністю видалити. Крім того, сайленсинг дає більш повне уявлення про розвиток захворювань, оскільки хвороби, як правило, пов'язані з генами, що мають знижену експресію.

Типи ред.

Транскрипційний ред.

Пост-транскрипційний ред.

Мейотичний ред.

Методи дослідження ред.

Антисенсові олігонуклеотиди ред.

Антисенсові (антисмислові) олігонуклеотиди були відкриті в 1978 році Полем Замєчником та Мері Стівенсон.[5] Олігонуклеотиди, що представляють собою короткі фрагменти нуклеїнової кислоти, зв'язуються з комплементарними молекулами мРНК-мішені, коли їх додають до клітини[6]. Ці молекули можуть складатися з одноланцюгової ДНК або РНК і, як правило, мають довжину 13–25 нуклеотидів[7]. Антисенсові олігонуклеотиди можуть впливати на експресію генів двома способами: за допомогою механізму РНКаза H- залежного механізму або за допомогою стеричного блокувального механізму . РНКаза-Н-залежні олігонуклеотиди викликають деградацію молекул-мішеней мРНК, тоді як олігонуклеотиди стеричних блокаторів перешкоджають трансляції молекули мРНК . Більшість антисмислових лікарських препаратів функціонують через РНКаза H-залежний механізм, в якому РНКаза H гідролізує нитку РНК гетеродуплексу ДНК/РНК . Цей механізм вважається більш ефективним, що призводить до зниження експресії білка та мРНК приблизно на 80 % до 95 %.

Рибозими ред.

Рибозими - це каталітичні молекули РНК, які пригнічують експресію генів . Ці молекули працюють, розщеплюючи молекули мРНК, по суті піддаючи сайленсингу гени, що їх продукували. Сідні Альтман та Томас Чех вперше виявили каталітичні молекули РНК, РНКазу Р та інтронні рибозими групи II, у 1989 році та отримали Нобелівську премію за своє відкриття[8][9]. Існує кілька типів мотивів рибозимів, серед яких молоток, шпилька, вірус гепатиту дельта, група I, група II і рибозими РНКази Р. Мотиви рибозиму молотка, шпильки та вірусу гепатиту дельта (HDV) зазвичай зустрічаються у вірусах або вірусних РНК . Ці мотиви здатні самостійно розщеплювати специфічний фосфодіефірний зв'язок на молекулі мРНК . Нижчі еукаріоти та деякі бактерії містять рибозими I та II групи. Ці мотиви можуть сплайсингуватися самі з собою, розщеплюючи та з'єднуючь між собою фосфодіефіріи зв'язми . Останній з наведених мотивів рибозиму — рибозим РНКази Р — знайдено у Escherichia coli, він відомий своєю здатністю розщеплювати фосфодіефірні зв'язки кількох попередників тРНК під час приєднання до білкового кофактора .

РНК-інтерференція ред.

 
Ліворуч: Загальна схема РНК-інтерференції.

Інтерференція РНК (RNAi) — це природний процес, що використовується клітинами для регулювання експресії генів. Він був відкритий в 1998 році Ендрю Файром та Крейгом Мелло, які отримали за своє відкриття Нобелівську премію в 2006 році. Процес сайленсингу генів спочатку починається з надходження в клітину дволанцюгової молекули РНК (dsRNA), яка запускає шлях РНКі. Потім дволанцюгова молекула розрізається на невеликі дволанцюгові фрагменти ферментом, який називається Dicer . Ці невеликі фрагменти, які включають невеликі інтерферуючі РНК (siRNA) та мікроРНК (miRNA), мають довжину приблизно 21–23 нуклеотидів. Фрагменти інтегруються в мульти-субодиничний білок, який називається РНК-індукованим комплексом сайленсингу, який містить білки Аргонавта, які є основними компонентами шляху РНКі . Один ланцюг молекули, який називається «направляючим» ланцюгом, зв'язується з RISC, а інший, відомий як «пасажирський» ланцюг, деградує. Направляючий, або антисенсовий ланцюг фрагмента, що залишається зв'язаним з RISC, спрямовує специфічний щодо послідовності сайленсинг молекули цільової мРНК. Гени можна піддати сайленсингу молекулами siRNA, які викликають ендонуклеотичне розщеплення цільових молекул мРНК, або молекулами miРНК, які пригнічують трансляцію молекули мРНК. З розщепленням або трансляційною репресією молекул мРНК гени, що їх утворюють, робляться по суті неактивними. Вважається, що РНКі розвинувся як механізм захисту клітин від проникнення чужорідних організмів, таких як РНК-віруси, або для боротьби з розповсюдженням транспозонів у ДНК клітини . І РНК-віруси, і транспозони можуть існувати як дволанцюгові РНК і призводити до активації РНКі. В даний час siRNA широко використовуються для пригнічення специфічної експресії генів та оцінки функції генів. Компанії, що використовують цей підхід, включають Alnylam, Sanofi, Arrowhead, Discerna, та Persomics.

Три основні області, які не транслюються, та мікроРНК ред.

Три основні області, які не транслюються (3'UTR) матричних РНК (мРНК) часто містять регуляторні послідовності, які після транскрипції викликають сайленсинг генів. Такі 3'-UTR часто містять сайти зв'язування мікроРНК (miRNA), а також регуляторні білки. Зв'язуючи конкретні сайти в межах 3'-UTR, велика кількість специфічних міРНК знижує експресію генів своїх конкретних цільових мРНК шляхом інгібування трансляції, або безпосередньо викликаючи деградацію транскрипту, використовуючи механізм, подібний до інтерференції РНК (див. MicroRNA). 3'-UTR також може мати області сайленсера, які зв'язують репресорні білки, що інгібують експресію мРНК.

Застосування ред.

Медичні дослідження ред.

Методи сайленсингу генів широко використовуються дослідниками для вивчення генів, пов'язаних з хворобами. Ці розлади включають рак, інфекційні захворювання, респіраторні захворювання та нейродегенеративні розлади. В даний час генний сайленсинг також використовується в методах виявлення наркотиків, таких як синтетична летальність, високопродуктивний скринінг та мініатюрні екрани RNAi.

Рак ред.

РНК-інтерференція використовується для сайленсингу генів, асоційованих з декількома видами раку. В in vitro дослідженнях хронічного мієлолейкозу (СМЛ) siPHK використовували для розщеплення злитого білка BCR-ABL, що перешкоджає зв'язку препарату Gleevec (іматиніб) з раковими клітинами[10]. Розщеплення злитого білку зменшувало кількість трансформованих кровотворних клітин, які поширюються по всьому організму за рахунок підвищення чутливості клітин до препарату . РНК-інтерференція може також використовуватися для націлювання на конкретні мутанти. Наприклад, siRNA були здатні специфічно зв'язуватися з молекулами супресору пухлини р53, що містять мутацію в одній точці, і знищувати її, залишаючи супресор дикого типу неушкодженим[11].

Інфекційні захворювання ред.

Віруси ред.

Вірусні гени та гени клітин-хазяїнів, необхідні вірусам для розмноження або потрапляння в клітину, або які відіграють важливу роль у життєвому циклі вірусу, часто є мішенями для противірусної терапії. RNAi використовувалися для націлювання генів на кілька вірусних захворювань, таких як вірус імунодефіциту людини (ВІЛ) та гепатит[12][13]. Зокрема, siRNA була використана для замовчування первинного рецептора хемокінового рецептора ВІЛ 5 (CCR5)[14]. Це заважало вірусу потрапляти в лімфоцити периферичної крові людини та первинні гемопоетичні стовбурові клітини[15]. Подібна методика була використана для зменшення кількості виявленого вірусу в клітинах, інфікованих гепатитом В та С. При гепатиті В для сайленсингу поверхневого антигену вірусу гепатиту В використовували сайленсинг на основі siRNA, що призводило до зменшення кількості вірусних компонентів[16]. Крім того, методи siPHK, що застосовуються при гепатиті С, знижували кількість вірусу в клітині на 98 %[17][18].

Бактерії ред.
 
Будова типової грампозитивної бактеріальної клітини

На відміну від вірусів, бактерії не так чутливі до замовчування siRNA[19]. Передусім це пов'язано з тим, як розмножуються бактерії. Бактерії розмножуються поза клітиною-господарем і не містять необхідних механізмів для функціонування РНКі . Однак бактеріальні інфекції все-таки можна піддати сайленсингу з використанням siRNA шляхом націлення на ген клітин-господарів, які беруть участь у імунній відповіді, викликаній інфекцією, або шляхом націлювання на ген клітин-господарів, які опосередковують потрапляння бактерій у клітини[20]. Наприклад, siRNA використовували для зменшення кількості протизапальних цитокінів, експресованих у клітинах мишей, оброблених ліпополісахаридом (LPS)[21]. Зниження експресії запального цитокіну, фактора некрозу пухлини α (TNFα), у свою чергу, спричинило зменшення септичного шоку, якого зазнавали миші, які отримували ЛПС . Крім того, siRNA була використана для запобігання потрапляння бактерій, Psueomonas aeruginosa, до епітеліальних клітин легенів миші шляхом нокдауну гена кавеоліну-2 (CAV2)[22]. Таким чином, хоча механізми siRNA не можуть бути безпосередньо націлені на бактерії, вони все одно можуть бути уражені siRNA, коли націлені компоненти, що беруть участь у бактеріальній інфекції.

Респіраторні захворювання ред.

Рибозими, антисмислові олігонуклеотиди та нещодавно РНКі використовувались для націлювання молекул мРНК, що беруть участь у розвитку астми[20][23]. Ці експерименти дозволили припустити, що siRNA можна використовувати для боротьби з іншими респіраторними захворюваннями, такими як хронічна обструктивна хвороба легень (ХОЗЛ) та муковісцидоз . ХОЗЛ характеризується гіперплазією келихоподібних клітин та гіперсекрецією слизу[24]. Виявлено, що секреція слизу знижується, якщо натрансформуючий фактор росту (TGF) -α націлити siRNA в епітеліальних клітинах NCI-H292 дихальних шляхів людини[25]. Крім гіперсекреції слизу, хронічне запалення та пошкоджена тканина легенів характерні для ХОЗЛ та астми. Вважається, що трансформуючий фактор росту TGF-β відіграє певну роль у цих проявах[26][27]. В результаті, коли інтерферон (IFN)-γ використовувався для нокдауну TGF-β, зменшувалися показникфіброзу легень, спричиненого пошкодженням та рубцюванням легеневої тканини[28][29].

Нейродегенеративні розлади ред.

Хвороба Гантінгтона ред.
 
Кристалографічна структура N-кінцевої області білка Гантінгтона людини.

Хвороба Гантінгтона (HD) є результатом мутації гена білку гантінгтіну, яка викликає надлишок повторів CAG[30]. Потім ген утворює мутований білок гантінгтін з поліглютаміном, що повторюється поблизу амінного кінця молекули[31]. Ця хвороба невиліковна і, як відомо, викликає руховий, когнітивний та поведінковий дефіцити[32]. Дослідники розглядали можливість сайленсингу генів як потенційного терапевтичного факту для ХГ.

Аміотрофічний бічний склероз ред.

Аміотрофічний латеральний склероз (АЛС), який також називають хворобою Лу Геріга, — це захворювання моторних нейронів, що вражає головний і спинний мозок. Захворювання призводить до переродження моторних нейронів, що врешті-решт веде до загибелі нейронів та м'язової дегенерації[33]. Було виявлено, що АЛС можуть спричиняти сотні мутацій гена супероксиддисмутази Cu/Zn (SOD1)[34]. Сайленсинг генів використовували для нокдауну мутованої форми SOD1, характерного для АЛС[35]. Зокрема, молекули siRNA успішно використовуються для націлення на мутантний ген SOD1 та зменшення його експресії за рахунок алель-специфічного сайленсингу гена[36].

Проблеми застосування для терапії ред.

 
Основний механізм, який використовують вірусні вектори для доставки генів до клітин-мішеней. Показаний приклад — лентивірусний вектор.

Існує кілька проблем, пов'язаних із терапією на основі сайленсингу генів, включаючи доставку до цільових клітин та їхню специфіку. Наприклад, для лікування нейродегенеративних порушень молекули для сайленсинг-терапії повинні надходити до мозку. Гематоенцефалічний бар'єр ускладнює доставку молекул до мозку через кров, запобігаючи проходженню більшості молекул, які вводяться в кров[30][31]. Таким чином, дослідники виявили, що вони повинні безпосередньо вводити молекули у мозок або застосовувати спеціальні імплантовані помпи.

Їжа ред.

Арктичні яблука — це набір торговельних марок[37] які містять ознаку відсутності побуріння тканин, створену за допомогою сайленсингу генів, які відповідають за експресію поліфенолоксидази (ПФО). Це перший затверджений харчовий продукт, у якому застосовано цю технологію[38].

Див. також ред.

Список літератури ред.

  1. ↑ Redberry, Grace (2006). Gene silencing : new research. New York: Nova Science Publishers. ISBN 9781594548321.
  2. ↑ Gene Silencing. National Center for Biotechnology Information. Процитовано 11 листопада 2013.
  3. ↑ Hood E (March 2004). RNAi: What's all the noise about gene silencing?. Environmental Health Perspectives. 112 (4): A224—9. doi:10.1289/ehp.112-a224. PMC 1241909. PMID 15033605.
  4. ↑ Mocellin S, Provenzano M (November 2004). RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology. Journal of Translational Medicine. 2 (1): 39. doi:10.1186/1479-5876-2-39. PMC 534783. PMID 15555080.{{cite journal}}: Обслуговування CS1: Сторінки із непозначеним DOI з безкоштовним доступом (посилання)
  5. ↑ Kole R, Krainer AR, Altman S (February 2012). RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (2): 125—40. doi:10.1038/nrd3625. PMC 4743652. PMID 22262036.
  6. ↑ Dias N, Stein CA (March 2002). Antisense oligonucleotides: basic concepts and mechanisms. Molecular Cancer Therapeutics. 1 (5): 347—55. PMID 12489851.
  7. ↑ Kurreck J (March 2004). Antisense and RNA interference approaches to target validation in pain research. Current Opinion in Drug Discovery & Development. 7 (2): 179—87. PMID 15603251.
  8. ↑ Phylactou, L. (1 вересня 1998). Ribozymes as therapeutic tools for genetic disease. Human Molecular Genetics. 7 (10): 1649—1653. doi:10.1093/hmg/7.10.1649. PMID 9735387.
  9. ↑ Shampo MA, Kyle RA, Steensma DP (October 2012). Sidney Altman--Nobel laureate for work with RNA. Mayo Clinic Proceedings. 87 (10): e73. doi:10.1016/j.mayocp.2012.01.022. PMC 3498233. PMID 23036683.
  10. ↑ Chen J, Wall NR, Kocher K, Duclos N, Fabbro D, Neuberg D, Griffin JD, Shi Y, Gilliland DG (June 2004). Stable expression of small interfering RNA sensitizes TEL-PDGFbetaR to inhibition with imatinib or rapamycin. The Journal of Clinical Investigation. 113 (12): 1784—91. doi:10.1172/JCI20673. PMC 420507. PMID 15199413.
  11. ↑ Martinez LA, Naguibneva I, Lehrmann H, Vervisch A, Tchénio T, Lozano G, Harel-Bellan A (November 2002). Synthetic small inhibiting RNAs: efficient tools to inactivate oncogenic mutations and restore p53 pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23): 14849—54. Bibcode:2002PNAS...9914849M. doi:10.1073/pnas.222406899. PMC 137507. PMID 12403821.
  12. ↑ Dave RS, Pomerantz RJ (December 2004). Antiviral effects of human immunodeficiency virus type 1-specific small interfering RNAs against targets conserved in select neurotropic viral strains. Journal of Virology. 78 (24): 13687—96. doi:10.1128/JVI.78.24.13687-13696.2004. PMC 533941. PMID 15564478.
  13. ↑ Wilson JA, Jayasena S, Khvorova A, Sabatinos S, Rodrigue-Gervais IG, Arya S, Sarangi F, Harris-Brandts M, Beaulieu S, Richardson CD (March 2003). RNA interference blocks gene expression and RNA synthesis from hepatitis C replicons propagated in human liver cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5): 2783—8. Bibcode:2003PNAS..100.2783W. doi:10.1073/pnas.252758799. PMC 151418. PMID 12594341.
  14. ↑ Qin XF, An DS, Chen IS, Baltimore D (January 2003). Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1): 183—8. Bibcode:2002PNAS..100..183Q. doi:10.1073/pnas.232688199. PMC 140921. PMID 12518064.
  15. ↑ Li MJ, Bauer G, Michienzi A, Yee JK, Lee NS, Kim J, Li S, Castanotto D, Zaia J, Rossi JJ (August 2003). Inhibition of HIV-1 infection by lentiviral vectors expressing Pol III-promoted anti-HIV RNAs. Molecular Therapy. 8 (2): 196—206. doi:10.1016/s1525-0016(03)00165-5. PMID 12907142.
  16. ↑ Giladi H, Ketzinel-Gilad M, Rivkin L, Felig Y, Nussbaum O, Galun E (November 2003). Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Molecular Therapy. 8 (5): 769—76. doi:10.1016/s1525-0016(03)00244-2. PMID 14599810.
  17. ↑ Randall G, Grakoui A, Rice CM (January 2003). Clearance of replicating hepatitis C virus replicon RNAs in cell culture by small interfering RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1): 235—40. Bibcode:2002PNAS..100..235R. doi:10.1073/pnas.0235524100. PMC 140937. PMID 12518066.
  18. ↑ Randall G, Rice CM (June 2004). Interfering with hepatitis C virus RNA replication. Virus Research. 102 (1): 19—25. doi:10.1016/j.virusres.2004.01.011. PMID 15068876.
  19. ↑ Lieberman J, Song E, Lee SK, Shankar P (September 2003). Interfering with disease: opportunities and roadblocks to harnessing RNA interference. Trends in Molecular Medicine. 9 (9): 397—403. doi:10.1016/s1471-4914(03)00143-6. PMC 7128953. PMID 13129706.
  20. ↑ а б Leung RK, Whittaker PA (August 2005). RNA interference: from gene silencing to gene-specific therapeutics. Pharmacology & Therapeutics. 107 (2): 222—39. doi:10.1016/j.pharmthera.2005.03.004. PMC 7112686. PMID 15908010.
  21. ↑ Systemic delivery of synthetic siRNAs. RNA Therapeutics. Methods in Molecular Biology. Т. 629. 2010. с. 87—91. doi:10.1007/978-1-60761-657-3_6. ISBN 978-1-60761-656-6. PMID 20387144.
  22. ↑ Zaas DW, Duncan MJ, Li G, Wright JR, Abraham SN (February 2005). Pseudomonas invasion of type I pneumocytes is dependent on the expression and phosphorylation of caveolin-2. The Journal of Biological Chemistry. 280 (6): 4864—72. doi:10.1074/jbc.M411702200. PMID 15545264.{{cite journal}}: Обслуговування CS1: Сторінки із непозначеним DOI з безкоштовним доступом (посилання)
  23. ↑ Popescu FD, Popescu F (September 2007). A review of antisense therapeutic interventions for molecular biological targets in asthma. Biologics. 1 (3): 271—83. PMC 2721314. PMID 19707336.
  24. ↑ Pistelli R, Lange P, Miller DL (May 2003). Determinants of prognosis of COPD in the elderly: mucus hypersecretion, infections, cardiovascular comorbidity. The European Respiratory Journal. Supplement. 40: 10s—14s. doi:10.1183/09031936.03.00403403. PMID 12762568.
  25. ↑ Shao MX, Nakanaga T, Nadel JA (August 2004). Cigarette smoke induces MUC5AC mucin overproduction via tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme in human airway epithelial (NCI-H292) cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 287 (2): L420—7. doi:10.1152/ajplung.00019.2004. PMID 15121636.
  26. ↑ Rennard SI (November 1999). Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (5 Pt 2): S12—6. doi:10.1164/ajrccm.160.supplement_1.5. PMID 10556162.
  27. ↑ Sacco O, Silvestri M, Sabatini F, Sale R, Defilippi AC, Rossi GA (2004). Epithelial cells and fibroblasts: structural repair and remodelling in the airways. Paediatric Respiratory Reviews. 5 Suppl A: S35—40. doi:10.1016/s1526-0542(04)90008-5. PMID 14980241.
  28. ↑ Pulmonary Fibrosis. Mayo Clinic. Процитовано 13 грудня 2013.
  29. ↑ Gurujeyalakshmi G, Giri SN (Sep–Oct 1995). Molecular mechanisms of antifibrotic effect of interferon gamma in bleomycin-mouse model of lung fibrosis: downregulation of TGF-beta and procollagen I and III gene expression. Experimental Lung Research. 21 (5): 791—808. doi:10.3109/01902149509050842. PMID 8556994.
  30. ↑ а б Gene Silencing. HOPES - Huntington's Outreach Project for Education, at Stanford. Stanford University. 5 квітня 2012. Процитовано 13 грудня 2013.
  31. ↑ а б Mantha N, Das SK, Das NG (September 2012). RNAi-based therapies for Huntington's disease: delivery challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 3 (9): 1061—76. doi:10.4155/tde.12.80. PMID 23035592.
  32. ↑ Harper SQ (August 2009). Progress and challenges in RNA interference therapy for Huntington disease. Archives of Neurology. 66 (8): 933—8. doi:10.1001/archneurol.2009.180. PMID 19667213.
  33. ↑ What is ALS?. The ALS Association.
  34. ↑ Geng CM, Ding HL (February 2008). Double-mismatched siRNAs enhance selective gene silencing of a mutant ALS-causing allele. Acta Pharmacologica Sinica. 29 (2): 211—6. doi:10.1111/j.1745-7254.2008.00740.x. PMID 18215350.
  35. ↑ Boulis, Nicholas. Gene Therapy for Motor Neuron Disease. Society for Neuroscience. Процитовано 13 грудня 2013.
  36. ↑ Ding H, Schwarz DS, Keene A, Affar el B, Fenton L, Xia X, Shi Y, Zamore PD, Xu Z (August 2003). Selective silencing by RNAi of a dominant allele that causes amyotrophic lateral sclerosis. Aging Cell. 2 (4): 209—17. doi:10.1046/j.1474-9728.2003.00054.x. PMID 12934714.
  37. ↑ Petition for Determination of Nonregulated Status: Arctic™ Apple (Malus x domestica) Events GD743 and GS784. United States Department of Agriculture — Animal and Plant Health Inspection Service. Retrieved 2012-08-03.
  38. ↑ Apple-to-apple transformation. Okanagan Specialty Fruits. Архів оригіналу за 25 вересня 2013. Процитовано 3 серпня 2012.

Посилання ред.

Отримано з https://uk.wikipedia.org/w/index.php?title=Сайленсинг_генів&oldid=41042067