Трансформація (генетика): відмінності між версіями

Охолодження клітин при наявності двовалентних катіонів, наприклад Ca²⁺ (у CaCl₂), робить клітинні мембрани більш проникними до [[плазміда|плазмідної ДНК]]. Бактерії культивуються з ДНК, а потім раптово нагріваються (до 42 °C протягом 30-60 секунд), що примушує ДНК до проникнення до клітини. Цей метод добре працює для кільцьової ДНК плазмід, але не для лінійних фрагментів хромосомної ДНК. Ефективність трансформації для високо компетентних клітин становить близько 10⁸ випадків трансформації на мкг ДНК плазміди. Низько-компетентні клітини дають 10⁴ / мкг або менше. Хороші непромислові підготовки повинні надати 10⁵-10⁶ трансформацій на мкг ДНК [[Плазміда|плазміди]]. Максимальна кількість компетентних клітин спостерігається в кінці фази логаритмічногологарифмічного росту і при подальшому суворому дотриманні низьких температур (4 °C) середовища при приготуванні клітин.

* Трансформація за допомогою ''[[Agrobacterium tumifaciens]]''. ''Agrobacterium tumifaciens'' — це природня бактерія, яка паразитує на рослинах і містить спеціальну Ti — [[Плазміда|плазміду]], в склад якої входить Т-ДНК, що здатна проникати в клітину рослини господаря і вбудовуватись в геном, а також vir-гени, відповідальні за процес переносу ДНК. Т-ДНК містить гени синтезу рідкихрідкісних амінокислот і вуглеводів (опінів), якими живиться бактерівбактерія, а також гени фітогормонів, що спричиняють пухлиноподібний ріст рослинних тканин. Рецептори на поверхні бактерії сприймають продукти розкладурозпаду рослинної клітинної стінки, в результаті чого активуються vir-гени, продукти яких сприяють процесу переносу Т-ДНК в рослинну клітину. Сама бактерія в рослинну клітину при цьому не потрапляє. Для генетичної трансформації рослинної клітини використовують бінарну веторну систему, яка складається з '''[[Плазміда|плазміди]], що містить Т-ДНК''', де гени синтезу опінів і пухлиноутворюючих фітогормонів замінені на цільовий ген, який має вбудуватись і '''хелперної плазміди''', що містить vir-гени, що обслуговують процес переносу ДНК. <ref>Schell J, Van Montagu M., The Ti-plasmid of Agrobacterium tumefaciens, a natural vector for the introduction of nif genes in plants?, Basic Life Sci. 1977;9:159-79</ref><ref>Joos H, Timmerman B, Van Montagu M, Schell J, Genetic analysis of transfer and stabilization of Agrobacterium DNA in plant cells, EMBO J. 1983; 2(12): 2151–2160</ref>. Рослинна тканина (найчастіше, листя) нарізається на маленькі шматки, (близько 10x10 мм) і поміщається на 10 хвилин в середовище з ''Agrobacterium'', який містить [[Плазміда|плазміду]] для перенесення. Здатність рослин утворювати на місці поранення [[Меристема|меристематичну]] тканину, яка при певних умовах (фітогормональному складі середовища ''in vitro'') здатна до [[Регенерація (біологія)|регенерації]] і утворює [[Вегетативні органи|вегетативні пагони]] з окремих трансформованих клітин. Далі рослини вирощуються на селективному середовищі.

Деякі види рослин можуть бути трансформовані методом ''in planta'' шляхом вакуумного "присмоктування" агробактерії до рослинної тканини. Це може бути як стабільна трансформація шляхом зараженнямзараження квіток (в такому разі трансформується ембріональна тканина), а потім висіванням насіння на селективне середовищі, або транзієнтна, шляхом вакуумної інфільтрації ДНК в листок.

* [[Вірусна трансформація]]: Генетичний матеріал упаковується у відповідному рослинному вірусі, а потім змінений вірус використовується для інфекції рослини. Геноми більшості рослинних вірусів складаються з одно-ланцюжковоїланцюгової РНК, який реплікується в цитоплазмі зараженої клітини. Так цей метод є [[трансфекція|трансфекцією]], а не реальною трансформацією, тому що вставлені гени ніколи не досягають [[ядро клітини|ядра клітини]] і не об'єднують з його геномом. Нащадки заражених рослин вільні від вірусу та від вставленого гена.