Patch-clamp: відмінності між версіями

Гігантська аналітична потужність цього методу полягає в тому, що він дозволяє спостерігати за поведінкою і хімічними перетвореннями окремих [[молекула|молекул]]. Різні модифікації методу дозволяють в експерименті мінятизмінювати різноманітні — а в сумі практично всі, що цікавлять — фактори, які здатні впливати на поведінку іонних каналів.

Головною метою методу є дослідження трансмембранних іонних потоків ([[Електричний струм|струмів]]). Живі клітини оточені мембраною, структурну основу якої складає подвійний шар [[ліпіди|ліпідів]], який слабо проникний для [[вода|води]] і практично непроникний для іонів невеликого [[радіус]]у. Однак клітина має обмінюватись цими речовинами з зовнішім середовищем. Крім того, трансмембранні іонні потоки важливі для процесів збудження клітини та передачі сигналів. Ці потоки здійснюються через вбудовані в мембрану [[білок|білки]] — канали та транспортери.

'''Транспортери''' — це білки, які утворюють з речовинами, що переносяться, комплекс з одного боку мембрани; після чого міняють конформацію так, що речовина, яка транспортується, опиняється по іншу сторону мембрани, і там її звільнюютьзвільняють. Зазначимо, що найважливіший транспортер в клітинах [[еукаріоти|еукаріот]] — це натрієво-калієва помпа, яка активно переносить за цикл своєї роботи 3 іони [[натрій|Na]]⁺ з клітини та 2 іони [[калій|K]]⁺ в клітину, використовуючи енергію [[АТФ]]. Одна молекула цього транспортеру виконує приблизно 10³ циклів за [[секунда|секунду]].

На рисунку 1 зображена частина установки для patch-clamp. Величезна сфера, частину якої видно на моніторі в центрі фотографії — це клітина ([[ооцит]] [[жаби]] ''Xenopus laevis''), що знаходиться на даний момент на предметному столику [[мікроскоп]]а, до ньогонеї підведена patch-піпетка, діаметр якої біля носика складає близько 3 мікрони. Після встановлення gigaseal вона ізолює фрагмент мембрани [[діаметр]]ом близько 3 мкм², і, якщо в цьому фрагменті трапляться іонні канали, то їхній струм можна буде записувати. Щойно описана конфігурація називається cell-attached patch-clamp. Вона ілюструється схемою, що зображена на рисунку 2.

Тепер різниця потенціалів на фрагменті мембрани точно дорівнює різниці потенціалів між електродами. Очевидно, що при використанні такої модифікації піпетку заповнють розчином, що імітує позаклітинну рідину, тоді як розчин, що омиває, роблять близкимблизьким до складу цитоплазми. При цьому, міняючи склад розчину, що омиває, можна досліджувати, як такі зміни в цитоплазмі (адже розчин, що омиває, контактує з цитоплазматичною стороною мембрани) будуть впливати на поведінку каналу. При цьому ми точно знаємо як склад рідини по обидва боки мембрани, так і різницю потенціалів, що дозволяє достатньо точно характеризувати канали, використовуючи [[рівняння Нернста]] та Гольдмана-Ходжкіна-Каца. Таким чином, на цьому рівні електофізіологія перетворюється на фізику каналів. При цьому, якщо в ізольовану ділянку мембрани попавпотрапив один іонний канал, то ми спостерігтимемо поведінку одиничної білкової молекули, і, якщо це ліганд-регульований канал-рецептор, то її взаємодію з іншими одиничними молекулами.

Якщо є необхідність здійснювати зміну складу позаклітинного середовища, можна не відводити піпетку від клітини, а подати в неї негативний тиск і зруйнувати ізольований шматочок мембрани, перейшовши таким чином в whole-cell mode (див. рисунок 4). Теперь піпетка з'єднана з внутрішньоклітинним середовищем. Оскільки об'єм клітини зазвичай набагато менший за об'єм піпетки, то, завдяки [[дифузія|дифузії]], склад внутрішньоклітинного середовища невдовзі виявляється ідентичним складу розчину, що в піпетці. Тому ми, як і в попередньому випадку, знаємо як склад всіх рідин, так і різницю потенціалів. До речі, якщо в конфігурації inside-out піпеточний електрод був позаклітинним, а внутрішній — внутрішньоклітинним, то тепер їхні ролі помінялись, так що задаючи потенціал, потрібно інвертувати полярність. Перевага цього методу полягає в тому, що тут виявляються збереженими всі клітинні структури і регуляторні механізми. Але є й недолік — ми вимірюємо весь сумарний струм всіх каналів у клітині, а ми щойно раділи потужності методаметоду, що дозволяє спостерігати поведінку окремої молекули. Як же ж бути? В цьому випадку використовується наступна модифікація методу, що називається оutside-out mode.

Наступна фаза процесу зображена на рисунку 5. Мембранна трубка стала зовсім тоненька і майже невидима («протуберанець» біля поверхні клітини — це невелика частина цитоплазми, яка залишилась в мембранній трубці). До речі, зверніть увагу — в піпетці виразно видно шматочки цитоплазми, що попалипотрапили туди після руйнування мембрани при переході в whole-cell.

По-перше, порівняно з класичним whole-cell mode, [[електричний опір]] доступу (що складається із опору піпетки та опору з'єднання піпетка-клітина) є значно вищим. Це знижує ступінь розрізнення [[електричний струм|електричного струму]], підвищує електричний шум при записі, та збільшує всі помилки, що виникають завдяки флуктуаціям опору повного ланцюгуланцюга (від електроду в піпетці до електроду в навколоклітинному розчині). По-друге, для того, щоб антибіотик виконав описану дію, потрібно доволі багато часу (до 30 хвилин), що суттєво зменшує корисний час експерименту. І по-третє, антибіотик пошкоджує мембрану в місці прилягання до піпетки, що призводить до швидшого руйнування гігаомного контакту і також зменшує ефективний експериментальний час. Таким чином, цей варіант методу може бути ефективно застосований тільки в експериментах, які не потребують тривалого часу для виявлення досліджуваних ефектів.

Voltage-clamp, або фіксація потенціалу, використовується при вивченні змін провідності однотипних каналів у відповідь на якісь хімічні впливи або ж залежність їхньої провідності від різниці потенціалів на мембрані, при цьому, за умови фіксації потенціалу, вимірюється струм каналу — як ми досі і описували. Приклад запису, щоякий при цьому можна отримати, наведено на рисунку 8. Це запис одиночного каналу [[гліциновий рецептор|гліцинового рецепторурецептора]]. Чітко видно два стани: закритий (йому відповідає нульовий струм, верхнє положення) та відкритий (йому відповідає струм приблизно в 7 пікоампер, нижнє положення). ВверхуВгорі — дані, отримувані безпосередньо в досліді; внизу — ті ж дані після фільтрації електричного шуму з частотою 50 [[Герц|Гц]]. Канал час від часу довільно переходить з одного стану в інший, проміжних станів нема. Запис дозволяє отримати дві найважливіші характеристики каналу: провідність (виходячи з величин трансмембранного потенціалу і струму) та [[імовірність]] знаходження у відкритому стані, що визначається як відношення часу, коли канал відкритий до часу, коли він закритий. До речі, частіше всього активність каналу фізіологічно регулюється саме шляхом зміни цієї імовірності.

Іноді дослідника цікавлять процеси трансмембранного переносу іонів, що пов'язані із зміною мембранного потенціалу — наприклад, проведення нервового імпульсу. В таких випадках можна вчинити навпаки: зафіксувати на постійному рівні струм (наприклад, можна припустити, що сумарний струм через всі іонні канали в коженкожний момент часу дорівнює нулю, тобто встановити нульовий струм), та вивчати при цьому зміну різниці потенціалів. Такий варіант називається current clamp. Приклад даних, щоякі при цьому можна отримати, наведено на рисунку 10.