Молекулярне клонування: відмінності між версіями
| [неперевірена версія] | [неперевірена версія] |
Вилучено вміст Додано вміст
Немає опису редагування |
|||
Рядок 35:
По-друге, необхідно обрати вектор для клонування. Векторна молекула повинна відповідати декільком обов'язковим умовам: 1) вектор повинен тривалий час існувати в популяції клітин-господарів (тобто реплікуватись або автонономно, або разом з хромосомами клітин); 2) має містити біохімічні або генетичні маркери, які дозволяли виявляти його у клітинах; 3) структура молекули повинна допускати вбудування в неї нуклеотидної послідовності без порушення її функціональної цілісності.<ref>{{cite book|author = Патрушев Л.И. | title = Экспрессия генов.| location= Москва | publisher = Наука,| year = 2000| page=558 }}</ref> Для конструювання векторів використовують плазміди, вірусні хромосоми, а також фрагменти хромосом еукаріотичних клітин. Сучасні векторні системи дозволяють створювати рекомбінантні молекули, що здатні нести у своєму складі послідовності довжиною до кількох сотень тисяч нуклеотидів (так звані [[штучна хромосома дріжджів|штучні хромосоми]]).
Типи векторних систем, що застосовуються у молекулярному клонуванні та їх характеристика:
{| class="standard"
!Вектор
!Величина клонованої послідовності (кілобази)
!Опис
!Недоліки
|-
!Плазміди
|До 20
|Невеликі кільцеві молекули ДНК, що існують в природі, як правило насамперед, у бактеріальних клітинах, і реплікуються автономно у клітині.
|Величина клонованої послідовності менша, за довжину еукаріотичних генів. Зі збільшення величини вставки падає ефективність лігування та трасформації клітин.
|-
!Фаг лямбда
|~15
|
|
|-
!Косміди
|45
|Гібриди плазмід з вірусними векторами
|
|-
!P1 фаг
|100
|
|
|-
!Штучні хромосоми
|300-1 000
|
|Часті делеції послідовностей всередені вектора та вставки
|}
Стандартна процедура клонування включає в себе 4 базових кроки:<ref>{{cite book|author = J. Reece | title = Analysis of Genes and Genomes| location= Manchester| publisher = Wiley-Blackwell| year = 2004| page=183}}</ref>
Рядок 44 ⟶ 77:
=== Отримання чужорідної ДНК ===
Існує велика кількість методів отримання геномної ДНК з клітин, але всі вони мають кілька загальних кроків.<ref>{{cite book|author = Michele K. Nishiguchi, Phaedra Doukakis, Mary Egan et al. | title = Methods and Tools in Biosciences and Medicine | location= Switzerland | publisher = Birkhauser Verlag Basel,| year = 2002| page=250-281}}</ref> Вони включають в себе наступне: 1) лізис клітин або тканин, звідки ДНК має бути виділена; 2) очищення від білків та РНК; 3) [[осадження|преципітація]] ДНК за допомогою ізопропанолу або етанолу. Для
|author= Tapper DP
|coauthors=Tapper DP, Van Etten RA, Clayton DA
| |||