Кінетика Міхаеліса — Ментен

Кіне́тика Міхае́ліса — Ме́нтен — у біохімії одна із найпростіших і найвідоміших моделей опису кінетики ферментативних реакцій. Говорять, що фермент слідує кінетиці Міхаеліса-Ментен, якщо для нього характерна гіперболічна залежність початкової швидкості каталізованої реакції (V₀) від концентрації субстрату ([S]), що описується рівнянням (рівняння Міхаеліса — Ментен):

Графік залежності початкової швидкості реакції від концентрації субстрату.

$V_{0}={\frac {d[P]}{dt}}={\frac {V_{\max }{[S]}}{K_{m}+[S]}}$,

де V_max — максимальна швидкість реакції, яка спостерігається тоді, коли фермент повністю насичений субстратом, K_m — константа Міхаеліса — концентрація субстрату, при якій швидкість реакції дорівнює половині максимальної. Константа Міхаеліса-Ментен має розмірність моль/л і часто використовується для кількісного вираження спорідненості ферменту до субстрату (чим менша K_m, тим більша спорідненість), проте таке її трактування не завжди коректне.

Залежність швидкості реакції від концентрацій субстрату

Леонор Міхаеліс.

Одним із основних чинників, які визначають швидкість ферментативної реакції, є концентрація субстрату. Проте в експериментальних умовах вимірювання цієї залежності ускладнюється тим, що концентрація субстрату в ході реакції знижується. Тому для спрощення використовують так звану початкову швидкість V₀, яка вимірюється не далі як у перші 60 с реакції, за цей час [S] встигає змінитись всього на кілька відсотків і її можна вважати наближеною до сталої величини. При незмінній концентрації ферменту і відносно невеликій концентрації субстрату швидкість реакції зростає майже лінійно при збільшенні [S] (реакція першого порядку). Проте поступово зростання стає повільнішим, аж поки при певній концентрації субстрату не виходить на плато, тобто спостерігається так званий ефект насичення. Отже після деякого значення [S] швидкість реакції наближається до максимальної V_max і не змінюється у відповідь на подальше зростання концентрації субстрату.

Виходячи із описаних спостережень, Віктор Генрі 1903 року висловив думку про те, що зв'язування ферменту (E) із субстратом (S) із утворенням фермент-субстратного комплексу є необхідним кроком ензиматичного каталізу. Далі розвинули цю гіпотезу Леонор Міхаеліс та Мод Ментен, які 1913 року постулювали, що першим, зворотним і відносно швидким, етапом реакції є формування фермент-субстратного комплексу (ES), який на другому, повільному, етапі перетворюється у вільний фермент та продукт (P):

$E+S\,{\overset {k_{+1}}{\underset {k_{-1}}{\rightleftharpoons }}}\,ES\,{\overset {k_{+2}}{\underset {k_{-2}}{\rightleftharpoons }}}\,E+P$.

(1)

Оскільки друга стадія є лімітуючою, то загальна швидкість реакції повинна бути пропорційна до концентрації фермент-субстратного комплексу (речовини, що перетворюється на цій стадії).

В будь-який момент часу частина ферменту існує і вільному вигляді, тоді як інша — у зв'язаному із субстратом (ES). Співвідношення між цими двома формами залежить від [S], при малих його значеннях більшість ферменту незв'язана, зростання [S] призводить до зростання [ES] до тих пір, поки всі активні центри молекул ферменту не будуть насичені субстратом. У таких умовах буде спостерігатись максимальна швидкість реакції.

Коли фермент тільки змішується із великою кількістю субстрату, концентрація ES різко зростає, цей період називається престаціонарним і триває кілька мікросекунд, через що його дуже важко спостерігати експериментально. Після цього система досягає стаціонарного стану, при якому швидкість утворення фермент-субстратного комплексу дорівнює швидкості його утворення, тобто [ES] залишається сталою величиною. Концепція стаціонарного стану була вперше запропонована Бріґґсом та Голдейном 1925 року.

Рівняння Міхаеліса-Ментен

Виходячи із припущення, що лімітуючою стадією ферментативної реакції є розпад фермент-субстратного комплексу на вільний фермент і продукт, Міхаеліс та Ментен вивели рівняння, що описує гіперболічну криву залежності початкової швидкості від концентрації субстрату:

$V_{0}={\frac {V_{\max }{[S]}}{K_{m}+[S]}}$

(2)

Наведене рівняння використовують тільки для односубстратних реакцій. Всі величини (V₀, V_max, K_m та [S]) можна виміряти експериментально.

Виведення рівняння Міхаеліса-Ментен

Сучасне виведення рівняння Міхаеліса — Ментен потребує кількох припущень. По-перше, вважається, що реакція перебуває у стаціонарному стані ([ES] — стала величина). По-друге, припускається, що концентрація продукту [P] на початку реакції є мізерною, через що можна ігнорувати реакцію P + S → ES і нехтувати константою швидкості k−2. Тобто рівняння ферментативного перетворення субстрату (1) модифікується таким чином: $E+S\,{\overset {k_{+1}}{\underset {k_{-1}}{\rightleftharpoons }}}\,ES\,{\overset {k_{+2}}{\longrightarrow }}\,E+P$ (3) [E] — загальна концентрація ферменту у вільній і зв'язаній формі; [S] — концентрація субстрату; оскільки зазвичай [S] >> [E], то вважаємо, що утворення фермент-субстратного компелксу не впливає суттєво на концентрацію субстрату; [ES] — концентрація фермент-субстратного комплексу; [E] — [ES] — концентарція вільного ферменту. Загальна швидкість реакції становить: $V_{0}=k_{+2}[ES]$ (4) Проте, оскільки [ES] визначити експериментально дуже важко, потрібно виразити його через інші величини. Швидкість реакції утворення фермент-субстратного комплексу становить (нехтуючи зворотним перетворенням продукту): ${\frac {d[ES]}{dt}}=k_{+1}([E]-[ES])[S]$ (5) Швидкість реакцій розпаду фермент-субстратного комплексу: $-{\frac {d[ES]}{dt}}=k_{-1}[ES]+k_{+2}[ES]$ (6) Для стаціонарного стану швидкість утворення фермент-субстратного комплексу рівна швидкості його розпаду, звідси: $k_{+1}([E]-[ES])[S]=k_{-1}[ES]+k_{+2}[ES]$ (7) Враховуючи що величина $(k_{-1}+k_{+2})/k_{+1}$ називається константою Міхаеліса $K_{m}$, маємо: $K_{m}={\frac {k_{-1}+k_{+2}}{k_{+1}}}={\frac {([E]-[ES])[S]}{[ES]}}$ (8) Звідси концентрація фермент-субстратного комплексу становитиме: $[ES]={\frac {[E][S]}{K_{m}+[S]}}$ (9) Тепер, використовуючи рівняння (4) та (9) можна виразити швидкість реакції таким чином: $V_{0}={\frac {k_{+2}[E][S]}{K_{m}+[S]}}$ (10) Максимальна швидкість реакції Vmax спостерігатиметься, коли весь фермент буде зв'язаний із субстратом, отже за умови, що [E] = [ES], V = Vmax. Звідси (4) перетворюється так: $V_{max}=k_{+2}[E]$ (11) Використовуючи вираз (11) можна спростити рівняння (10): $V_{0}={\frac {V_{max}[S]}{K_{m}+[S]}}$

Якщо розв'язати наведене рівняння для початкової швидкості реакції рівної половині максимальної $V_{0}={\frac {1}{2}}V_{max}$, то отримаємо: $K_{m}=[S]$. Отже константа Міхаеліса — це концентрація субстрату, при якій швидкість дорівнює половині максимальної.

Хоча виведення рівняння Міхеаліса — Ментен було запропоноване для простої двостадійної реакції, насправді його застосування не обмежується тільки ферментами, що діють за таким механізмом. Всі ферменти, для яких початкова швидкість реакції перебуває у гіперболічній залежності від концентрації субстрату, підкоряються кінетиці Міхаеліса — Ментен. Важливий виняток становлять регуляторні ферменти.

Хоча кінетичні константи K_m та V_max легко експериментально визначити для будь-якого ферменту, їхнє фізичне значення може суттєво відрізнятись в залежності від механізму реакції. Ці константи також не дають інформації про кількість, швидкість проходження і хімічну природу окремих кроків реакції.

Експериментальне визначення константи Міхаеліса

Графік Лайнвівера—Берка (метод подвійних зворотних величин).

Аналіз гіперболи Міхаеліса — Ментен не дає змоги точно експериментально встановити значення K_m та V_max, вони можуть бути оцінені тільки наближено. Тому були запропоновані інші методи обчислення, найпростішим із яких є метод Лайнвівера — Берка або подвійних зворотних величин. Рівняння Лайнвівера — Берка відображає залежність 1/V₀ від 1/[S]:

${\frac {1}{V}}={\frac {K_{m}}{V_{max}}}{\frac {1}{S}}+{\frac {1}{V_{max}}}$;

(12)

Графік цього рівняння відкладається у координатах 1/V₀ (вісь ординат) 1/[S] (вісь абсцис) і є лінійним. Він дозволяє легко отримати значення кінетичних констант V_max (перетин графіка із віссю 1/V₀ відповідає точці 1/V_max) та K_m (перетин графіка із віссю 1/[S] відповідає точці -1/ K_m). Тангенс кута нахилу прямої становить K_m/V_max. Отримані значення будуть досить неточними, оскільки обернені графіки типу Лайнівера — Берка візуально спотворюють значення похибок вимірювань, тому в сучасних обчисленнях використовують частіше чисельні методи нелінійної регресії для прямого рівняння Міхаеліса — Ментен.

Інтерпретація кінетичних констант

Константа Міхаеліса

Значення константи Міхаеліса суттєво відрізняється для різних ферментів і навіть для різних субстратів того ж ферменту. Часто, і зазвичай помилково, його трактують як кількісну міру спорідненості ферменту до субстрату. Справжнє фізичне значення константи Міхаеліса залежить від конкретного механізму реакції (кількості етапів і відносної швидкості кожного із них). Спорідненість ферменту до субстрату характеризує константа дисоціації або субстратна константа:

$K_{S}={\frac {k_{-1}}{k_{+1}}}$

(13)

Константа ж Міхаеліса визначається так:

$K_{m}={\frac {k_{-1}+k_{+2}}{k_{+1}}}$

(14)

Отже вона буде наближатись до значення субстратної константи тільки у тому випадку, коли k₋₁ >> k₊₂. Тобто K_m є мірою спорідненості ферменту до субстрату тільки тоді, коли швидкість розпаду фермент-субстратного комплексу на фермент та субстрат значно переважає швидкість його розпаду на фермент і продукт. Проте в багатьох випадках k₋₁ << k₊₂ або обидві константи приблизно рівні. Навіть частіше спостерігається ситуація, коли за утворенням фермент-субстратного комплексу слідує ще серія послідовних перетворень, тоді константа Міхаеліса стає складною функцією багатьох констант швидкості.

Експериментально встановлено, що значення K_m зазвичай близьке до реальної концентрації субстрату в клітині.

Максимальна швидкість і число обертів

Максимальна швидкість реакції визначається як $V_{max}=k_{+2}[E]$ у випадку, коли етап розпаду фермнет-субстратного комплексу на вільний фермент та продукт є лімітуючим. Проте багато кількастадійних реакцій можуть обмежуватись якимось іншим етапом. Тому зручно ввести загальну константу швидкості k_cat, що описує лімітуючу стадію або стадії реакції. Наприклад для реакції (1) k_cat = k₊₂. В загальному випадку $V_{max}=k_{cat}[E]$, тоді рівняння Міхаеліса — Ментен модифікується так:

$V_{0}={\frac {k_{cat}[E][S]}{K_{m}+[S]}}$

(15)

Константа k_cat має розмірність с⁻¹ і також називається числом обертів ферменту. Вона означає кількість молекул субстрату, що перетворюються однією молекулою ферменту за певну одиницю часу в умовах насичення ферменту субстратом.

Порівняння ефективності каталізу

Кінетичні константи K_m та k_cat дозволяють оцінювати ефективність каталізу певного ферменту, проте кожного з них окремо не достатньо для цього завдання. Наприклад два ферменти, що каталізують різні реакції, можуть мати однакове значення k_cat, проте міра в якій вони пришвидшують відповідні реакції, може різнитись, через те, що самі реакції за відсутності ферментів можуть протікати з різною швидкістю.

Для максимально точного порівняння каталітичної ефективності різних ферментів (або одного ферменту по відношенню до різних субстратів) використовують співвідношення k_cat/K_m, яке ще називається константою специфічності. Це константа для перетворення E + S → E + P. Коли [S] << K_m, то рівняння (15) перетворюється таким чином:

$V_{0}={\frac {k_{cat}}{K_{m}}}[E][S]$

(16)

k_cat/K_m у цьому рівнянні є константою другого порядку (вимірюється у л/моль·с або М⁻¹·c⁻¹). Для випадку розглянутого у виведенні рівняння Міхаеліса-Ментен враховуючи визначення константи Міхаеліса із (14):

${\frac {k_{cat}}{K_{m}}}={\frac {k_{+2}}{K_{m}}}={\frac {k_{+2}k_{+1}}{k_{+2}+k_{-1}}}$

(17)

Отже константа специфічності буде найбільшою, коли k₊₂ >> k₋₁, тобто, коли швидкість розпаду фермнет-субстратного комплексу із утворенням продукту значно переважає над швидкістю зворотної дисоціації до вільного ферменту та субстрату. В такому випадку k_cat/K_m = k₊₁. Максимальне значення k₊₁ (константи другого порядку для реакції утворення фермент-субстратного комплексу) обмежене швидкістю взаємної дифузії ферменту та субстрату, тобто найбільшою кількістю разів, які вони можуть стикатись в розчині. Ця межа контрольована дифузією становить 10⁸ М⁻¹·c⁻¹ — 10⁹ М⁻¹·c⁻¹. Деякі ферменти, наприклад супероксиддисмутаза, каталаза, фумараза та інші, досягнули так званої каталітичної досконалості, тобто вони каталізують реакцію фактично кожен раз, коли зустрічаються із субстратом, а k_cat/K_m для них лежить у межах 10⁸ М⁻¹·c⁻¹ — 10⁹ М⁻¹·c⁻¹.

Значення Km, kcat та kcat/Km для деяких ферментів
Фермент	Субстрат	Km, (моль/л)	kcat (c−1)	kcat/Km (М−1·c−1)
Ацетилхолінестераза	Ацетилхолін	9,5 × 10−5	1,4 × 104	1,5 × 108
Карбоангідраза	CO2	1,2 × 10−2	1,0 × 106	8,3 × 107
	HCO- 3	2,6 × 10−2	4,0 × 105	1,5 × 107
Каталаза	H2O2	2,5 × 10−2	1,0 × 107	4,0 × 108
Хімотрипсин	N-Ацетилгліцин етиловий естер	4,4 × 10−1	5,1 × 10−2	1,2 × 10−1
	N-Ацетилвалін етиловий естер	8,8 × 10−2	1,7 × 10−1	1,9
	N-Ацетилтирозин етиловий естер	6,6 × 10−4	1,9 × 102	2,9 × 105
Фумараза	Фумарат	5,0 × 10−6	8,0 × 102	1,6 × 108
	Малат	2,5 × 10−5	9,0 × 102	3,6 × 107
Супероксиддисмутаза	Супероксидний аніон (O2•-)	3,6 × 10−4	1,0 × 106	2,8 × 109
Уреаза	Сечовина	2,5 × 10−2	1,0 × 104	4,0 × 105
β-Лактамаза	Бензилпеніцилін	2,0 × 10−5	2,0 × 103	1,0 × 108

Світлим кольором виділені ферменти із значенням k_cat/K_m близьким до межі, що визначається дифузією.

Джерела

• Nelson D.L., Cox M.M. (2008). Lehninger Principles of Biochemistry (вид. 5th). W. H. Freeman. с. 194—199. ISBN 978-0-7167-7108-1.
• Voet D., Voet J.G. (2011). Biochemistry (вид. 4th). Wiley. с. 487—496. ISBN 978-0470-57095-1.
• Губський Ю.І. (2007). Біологічна хімія. Київ-Вінниця: Нова книга. с. 134—137. ISBN 978-966-382-017-0.